Peran N-linked Glycosylation pada Modifikasi Post-Translasi (Post Translational Modification [PTM]) Protein Toll-Like Receptor 4 (TLR 4)

Wike Astrid Cahayani

Protein Toll-Like Receptor 4 (TLR 4) adalah salah satu anggota keluarga protein TLR pada manusia yang disandi oleh gen TLR4 yang terletak pada kromosom 9q33.1.¹ Protein TLR 4 merupakan protein membran yang banyak terdapat pada plasenta, lien, dan sel leukosit. Bersama dengan protein CD14 dan protein MD-2, TLR 4 membentuk reseptor lipopolisakarida (LPS), berupa kompleks multi-protein, yang dapat mendeteksi LPS bakteri Gram-negatif.² Adanya pengikatan LPS dengan kompleks multi-protein tersebut akan mengaktifkan dua jalur transduksi sinyal intraseluler sekaligus. Jalur pertama yang melibatkan protein adaptor TIRAP dan MyD88 akan mengaktifkan NF-kappa-B dan menginduksi terbentuknya sitokin proinflamasi.^2,3 Jalur kedua yang dimediasi oleh protein adaptor TRAM dan TRIF akan mengaktifkan produksi IFN tipe I IRF-3-dependent dan meningkatkan produksi molekul kostimulator.³ Dengan demikian, kompleks TLR 4/MD-2/CD14 berperan penting dalam mengaktifkan respon imun alami dan sebagai umpan awal terjadinya respon imun adaptif.

Agar dapat menjalankan fungsinya sebagai reseptor terhadap LPS, protein TLR 4 mengalami tahapan modifikasi post-translasi berupa N-linked glycosylation. N-linked glycosylation merupakan penambahan oligosakarida pada atom nitrogen, dan biasanya pada residu Asparagin (Asn). Pada TLR 4, N-linked glycosylation yang terjadi pada Asn-526 dan Asn-575 berperan penting dalam memodulasi ekspresi TLR 4 di permukaan membran sehingga dapat berfungsi sebagai reseptor LPS. ^4,5,6 Proses N-linked glycosylation ini terjadi di retikulum endoplasma kasar (RE kasar) dan dilanjutkan di apparatus Golgi. Setelah mengalami maturasi di apparatus Golgi, TLR 4 kemudian ditransfer ke membran sel dan berfungsi sebagai protein membran (reseptor LPS).⁴

Pentingnya peran N-linked glycosylation terhadap TLR 4 telah dibuktikan melalui sejumlah penelitian. Salah satunya, penelitian da Silva Correia dan Ulevitch (2002) yang mendemonstrasikan mutasi gen TLR4 pada human embryonic kidney 293 cell line melalui metode transfeksi liposom. Mutasi tersebut akan menghasilkan protein TLR 4 mutan. Mutasi dikonstruksikan di sembilan tempat N-linked glycosylation pada protein TLR 4 dengan mengganti residu asparagin dengan residu alanin (Ala), yaitu pada posisi Asn-35, Asn-173, Asn-205, Asn-282, Asn-309, Asn-497, Asn-526, Asn-575, dan Asn-624. Dari kesembilan posisi mutasi tersebut, dilakukan konstruksi secara progresif sehingga dihasilkan protein TLR 4 mutan seperti yang tercantum pada tabel 1.

Tabel 1 menunjukkan bahwa mutasi tunggal pada TLR 4 tidak mengubah fungsi maupun ekspresi dari TLR 4 untuk merespon LPS, kecuali mutasi yang melibatkan Asn-526 dan Asn-575. Sebaliknya, mutasi progresif yang terjadi pada beberapa posisi residu asparagin akan mengurangi fungsi TLR 4 dalam merespon LPS secara signifikan, demikian pula ekspresinya di permukaan membran. Sebagai contoh, mutasi pada mut 4.1 dan mut 5 akan menyebabkan TLR 4 sama sekali tidak merespon adanya LPS, meskipun terekspresi di permukaan membran sel. Sedangkan mutasi tunggal maupun progresif yang terjadi pada Asn-526 dan Asn-575, akan menyebabkan protein TLR 4 tidak berfungsi dan tidak terekspresi di permukaan membran sel. Hal ini disebabkan TLR 4 tidak dapat ditranspor dari apparatus Golgi ke membran sel sehingga tidak terjadi respon terhadap LPS.⁴

Tabel 1. N-linked glycosylation pada protein TLR 4 dibutuhkan untuk ekspresi TLR 4 di permukaan sel dan pengikatan dengan LPS bakteri (TLR4 wt = TLR4 wild type).⁵

Dari hasil penelitian da Silva Correia dan Ulevitch (2002) tersebut dapat disimpulkan bahwa N-linked glycosylation pada TLR 4, terutama pada posisi Asn-526 dan Asn-575, tidak hanya berperan penting dalam mengatur protein agar berfungsi optimal sebagaimana tugas spesifiknya, tetapi juga berperan dalam mengatur transpor protein dari kompartemen intraseluler (RE kasar dan apparatus Golgi) ke permukaan membran sel.

Selain didukung oleh N-linked glycosylation, fungsi dan ekspresi TLR 4 di permukaan membran sel juga terkait dengan protein lain yang turut berperan sebagai kompleks reseptor LPS. Dalam hal ini, protein MD-2 yang mengandalkan N-linked glycosylation pada modifikasi post-translasinya, berperan dalam melengkapi fungsi TLR 4 sebagai reseptor LPS.^4,5,6 Penelitian yang menjelaskan keterkaitan protein MD-2 dengan TLR 4 menunjukkan bahwa mutasi pada tempat terjadinya N-linked glycosylation pada protein MD-2 (posisi Asn-26 dan Asn-114), dapat mempengaruhi fungsi TLR 4 dalam menginisiasi terjadinya transduksi sinyal intraseluler sebagai respon terhadap LPS. Mutasi tersebut memang tidak mempengaruhi ekspresi MD-2 di permukaan membran maupun asosiasinya dengan protein TLR 4. Walaupun demikian, protein MD-2 mutan tidak mampu melengkapi fungsi TLR 4 dalam mengaktifkan NF-kappaB sekalipun terjadi pengikatan dengan LPS. Hal ini mengakibatkan tidak tercapainya transduksi sinyal intraseluler.⁵

Selain mempengaruhi fungsi optimal dari protein TLR 4, protein MD-2 juga berperan dalam meregulasi ekspresi protein TLR 4 di permukaan membran sel. Diketahui bahwa protein MD-2 terikat pada permukaan konkaf N-terminal dan domain sentral pada protein TLR 4. Regio Glu24-Lys47 pada N-terminal TLR4 bertanggung jawab pada pengikatan MD-2 dengan TLR 4. Adanya mutasi pada regio ini, yaitu residu sistein dimutasi menjadi residu alanin, menyebabkan terbentuknya protein TLR 4 mutan (TLR4^C29A, TLR4^C40A, dan TLR4^C29A,C40A) yang tidak dapat membentuk kompleks reseptor dengan MD-2 dan tidak dapat ditranspor ke permukaan membran. Adapun mutasi yang terjadi selain di regio tersebut, yaitu Cys-88 menjadi Ala-88 (TLR4^C88A), juga menunjukkan hasil serupa. Kegagalan dalam membentuk kompleks reseptor bersama MD-2 dan kegagalan ekspresi di permukaan membran ini diduga terkait terjadinya perubahan konformasional pada protein TLR 4, sebagai akibat adanya mutasi residu sistein menjadi residu alanin. Oleh karena itu, timbul asumsi tambahan bahwa MD-2 memiliki kemampuan seperti chaperon, di mana MD-2 seolah dapat menentukan apakah TLR 4 dapat terekspresi di membran atau tidak. Akan tetapi, mekanisme lebih jelas mengenai fenomena tersebut masih membutuhkan penelitian lebih lanjut.⁶

Referensi:

1. Rock F.L., Hardiman G., Timans J.C., Kastelein R.A., and Bazan J.F. 1998. A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (2): 588–93.
2. O00206 (TLR4_HUMAN). http://www.uniprot.org/uniprot/O00206. Last modified September 18, 2013. Version 142. (accessed October 9^th, 2013).
3. Shibata T., Motoi Y., Tanimura N., Yamakawa N., Akashi-Takamura S., Miyake K. 2011. Intracellular TLR4/MD-2 in macrophages senses Gram-negative bacteria and induces a unique set of LPS-dependent genes. Int Immunol. 23(8): 503-510.
4. da Silva Correia J. and Ulevitch R.J. 2002. MD-2 and TLR4 N-Linked Glycosylations Are Important for a Functional Lipopolysaccharide Receptor. J. Biol. Chem. 277: 1845-1854.
5. Ohnishi T., Muroi M., and Tanamoto K. 2001. N-Linked Glycosylations at Asn26 and Asn114 of Human MD-2 Are Required for Toll-Like Receptor 4-Mediated Activation of NF-κB by Lipopolysaccharide. J Immunol. 167: 3354-3359.
6. Nishitani C., Takahashi M., Mitsuzawa H., Shimizu T., Ariki S., Matsushima N., et al. 2009. Mutational analysis of Cys88 of Toll-like receptor 4 highlights the critical role of MD-2 in cell surface receptor expression. Int. Immunol. 21(8): 925–934.