Mekanisme Scriptaid sebagai Inhibitor Histon Deacetylases (HDACs)

Wike Astrid Cahayani

Materi genetik membutuhkan proteksi dan pengemasan dalam menjalankan proses regulasi, seperti transkripsi, replikasi, dan perbaikan materi genetik. Pada eukariota, sebagian besar peran proteksi dan pengemasan untai DNA ini dilakukan oleh protein histon, di mana protein histon merakit untai DNA menjadi nukleosom-nukleosom. Sekumpulan nukleosom bersama dengan sejumlah protein terkait lainnya akan membentuk kromatin. Setiap nukleosom terdiri dari 147 bp DNA yang melilit di sekitar histone core yang berisi dua salinan dari setiap histon, yaitu H2A, H2B, H3, dan H4 (Luger et al., 1997).  Untuk mengaktifkan regulasi DNA yang meliputi beragam proses, protein histon akan mengalami berbagai modifikasi post-translasional, yang meliputi asetilasi, ubiquitilasi, metilasi, fosforilasi, dan sumoilasi (Shahbazian dan Grunstein, 2007).

Sekitar lima puluh tahun yang lalu, Vincent Allfrey dan koleganya menemukan bahwa asetilasi grup ε-amino dari residu lisin pada histon memiliki andil yang penting dalam ekspresi gen (Allfrey et al, 1964). Asetilasi berperan dalam menetralkan muatan positif dari residu lisin histon sehingga dapat mengendurkan konformasi kromatin dan memungkinkan akses yang lebih besar bagi protein-protein terkait untuk melakukan transkripsi. Oleh karena itu, asetilasi secara umum pada histon dikaitkan dengan terjadinya aktivasi gen. Sebaliknya, penghilangan gugus asetil dari histon dapat menginduksi terjadinya kondensasi kromatin dan represi transkripsi pada gen (Haberland et al., 2009). Hal ini kemudian ditetapkan bahwa asetilasi lisin juga terjadi di sejumlah besar protein non-histon, seperti faktor transkripsi dan protein sitoplasma, dan mempengaruhi transkripsi gen dan proses seluler lainnya (Peng dan Seto, 2011). Asetilasi lisin pada histon merupakan bentuk modifikasi reversibel yang dikendalikan oleh aktivitas antagonis dari dua jenis enzim, yaitu histon asetilase (HATs) dan histon deasetilase (HDACs) (Shahbazian dan Grunstein, 2007). HATS mengkatalisis transfer gugus asetil dari asetil KoA ke grup ε-amino dari residu lisin. Sebaliknya, HDACs meningkatkan penghilangan gugus asetil dari residu lisin yang terasetilasi dan melepaskan molekul asetat (Gambar 1) (Peng dan Seto, 2011; Shahbazian dan Grunstein, 2007).

Gambar 1. HDACs mengkatalisis pemindahan gugus asetil dari residu lisin untuk meregenerasi grup ε-amino dan melepaskan molekul asetat. (Sumber: http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1574789112000750-gr1.jpg)

HDACs dapat berperan sebagai ko-represor transkripsi yang penting dalam sistem fisiologis dan patologis yang sangat bervariasi. Sampai saat ini, sudah 18 HDACs pada manusia yang telah diidentifikasi dan dikelompokkan menjadi empat kelas berdasarkan homologi dengan protein ragi (yeast), yaitu HDACs kelas I, II, III (sirtuins), dan IV. HDACs kelas I (HDAC1, 2, 3, dan 8) homolog dengan regulator transkripsi ragi RPD3, HDACs kelas II (HDAC4, 5, 6, 7, 9, dan 10) homolog dengan hda1 pada ragi, HDACs kelas III homolog dengan Sir2 (SIRT1, 2, 3, 4, 5, 6, dan 7), dan HDAC kelas IV yang hanya beranggotakan HDAC11 homolog dengan kelas I dan II. HDACs kelas I, II, dan IV juga disebut sebagai HDACs klasik dan  ketiganya merupakan Zn²⁺ enzim-dependent, sedangkan kelompok sirtuins memerlukan NAD⁺ sebagai kofaktor (Haberland et al., 2009).

Deasetilasi histon yang dikatalisis oleh HDACs dapat mempengaruhi transkripsi gen eukariot dengan cara menghambat jalan masuk faktor transkripsi, sehingga gen yang bertanggung jawab dalam supresi sel tumor menjadi inaktif. Oleh karena itu, inhibisi pada aktivitas HDACs merupakan strategi yang potensial dalam terapi kanker. Inhibisi HDACs oleh suatu inhibitor spesifik akan menginduksi penahanan pertumbuhan, diferensiasi, dan apoptosis pada sel kanker (Monneret, 2005).

Inhibitor HDACs merupakan kelas baru agen kemoterapi dan telah menunjukkan aktivitas antikanker terhadap jenis kanker yang beragam. Hingga saat ini telah banyak ditemukan senyawa protein yang dapat berperan sebagai inhibitor HDACs, salah satunya adalah 6-(1,3-dioxobenzo[de]isoquinolin-2-yl)-N-hydroxyhexanamide atau yang dikenal sebagai scriptaid. Scriptaid dikandidatkan sebagai salah satu inhibitor HDACs karena kemiripan strukturnya dengan salah satu kelompok inhibitor HDACs, yaitu trichostatin A (TSA) dari kelompok asam hidroksamat (Gambar 2) (Su et al., 2000). Berdasarkan penelitian lanjutan, scriptaid dilaporkan dapat menghambat aktivitas HDACs kelas I, yaitu HDAC1, HDAC3, dan HDAC8 (Hu et al., 2003).

Gambar 2. Kemiripan struktur antara TSA dengan scriptaid (Sumber: Su et al., 2000).

Mekanisme penghambatan HDACs oleh scriptaid tergambar lebih jelas dalam penelitian Lee et al. (2008) yang mengeksplorasi aktivitas scriptaid bersama 5-aza-dC dan TSA pada karsinoma kolorektal. Dalam studi ini, efek scriptaid pada pertumbuhan sel, siklus sel, apoptosis dan perubahan epigenetik diselidiki pada RKO colorectal cancer cell line. 

Pada penelitian Lee et al. (2008), scriptaid menunjukkan efek sinergis dengan 5-aza-dC dalam menghasilkan efek demetilasi dan re-ekspresi pada gen p16 yang mengalami hipermetilasi pada sel RKO. Akan tetapi, efek ini tidak akan timbul apabila scriptaid dan 5-aza-dC tidak dikombinasikan bersama-sama. Hal ini menunjukkan bahwa re-ekspresi yang penuh dari p16 membutuhkan complete reversal dari histon yang termodifikasi pada keadaan eurokromatik, di mana fungsi ini dapat dicapai dengan pengkombinasian scriptaid dan 5-aza-dC.

Asetilasi dan metilasi ekor histon pada kromatin memainkan peran penting dalam regulasi ekspresi gen. Pengaruh scriptaid pada modifikasi histon dalam penelitian Lee et al. (2008) adalah sebanding dengan TSA. Scriptaid dapat menginduksi modifikasi rantai histon yang penting dalam struktur kromatin dengan jalan meningkatkan asetil-H3-K9 dan dimetil-H3-K4 serta menurunkan dimetil-H3-K9, yang penting untuk represi gen pada promotor p16. Fakta bahwa scriptaid dapat memodifikasi histon adalah terlepas dari kegagalan scriptaid (tanpa dikombinasikan dengan 5-aza-dC) dalam melakukan demetilasi dan re-ekspresi pada gen p16 yang mengalami hipermetilasi. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat peran yang lebih dominan pada metilasi DNA atas aktivitas histon deasetilase untuk pemeliharaan inaktivasi gen (gene silencing) dalam hubungannya dengan hipermetilasi pada CpG islands di mamalia (Cameron et al., 1999).

Analisis siklus sel pada sel RKO menunjukkan bahwa pemberian scriptaid dengan konsentrasi 0,5 dan 1,0 µM dapat menginduksi G₁ arrest dan pemberian scriptaid dengan konsentrasi 2,0 µM dapat menginduksi G₁ arrest dan G₂/M arrest (Lee et al., 2008). Temuan ini konsisten dengan penelitian lain yang menunjukkan bahwa pemberian inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) dengan konsentrasi 2,5 dan 5,0 µM dapat menginduksi G₁ arrest pada sel T24 dan pemberian SAHA dengan konsentrasi yang lebih tinggi dapat menginduksi G₁ dan G₂ arrest (Richon et al., 2000). Dengan demikian, pengamatan tersebut menunjukkan bahwa penghentian siklus sel bergantung pada konsentrasi scriptaid dan inhibitor HDAC lain secara umum.

Induksi penghentian siklus sel oleh inhibitor HDAC sebagian besar terkait dengan penghambatan transkripsi siklin A dan siklin D, atau dengan aktivasi transkripsi dari p21_WAF1/CIP1, p27_KIP1 dan GADD45α (Lee et al., 2008). Namun, tingkat ekspresi protein-protein tersebut tidak berubah secara signifikan setelah pemberian scriptaid. Sebaliknya, adanya peningkatan ekspresi protein p14 dan GADD45G dan penurunan ekspresi siklin B2 dan siklin E2 setelah pemberian scriptaid menunjukkan bahwa mekanisme yang mendasari penghentian siklus sel dan inhibisi pertumbuhan sel oleh scriptaid mungkin berbeda dengan mekanisme inhibitor HDAC lainnya. 

Di samping menghentikan siklus sel, Lee et al. (2008) juga menemukan bahwa scriptaid dapat menghambat pertumbuhan sel. Pemberian scriptaid dengan konsentrasi 1,0 µM menghambat pertumbuhan sel RKO, di mana tidak ada efek sinergis yang timbul jika scriptaid dikombinasikan dengan 5-aza-dC. Sedikit berbeda dengan penelitian Keen et al. (2003) yang menemukan bahwa scriptaid yang dikombinasikan dengan 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC) dapat meningkatkan ekspresi estrogen receptor alpha yang dapat menekan pertumbuhan sel kanker payudara.

Terkait aspek apoptosis, dalam penelitian Lee et al. (2008) diketahui bahwa scriptaid tidak menginduksi terjadinya apoptosis pada sel RKO, karena hasil perbandingan apoptosis pada kontrol dengan sel yang diintervensi dengan scriptaid tidak menunjukkan perbedaan statistik secara bermakna. Hal ini berbeda dari penelitian yang dilakukan oleh Sharma et al. (2010), di mana mereka menemukan bahwa scriptaid menginduksi terjadinya apoptosis pada sel glioma melalui peningkatan aktivasi Jun N-terminal kinase (JNK). Scriptaid juga meningkatkan ekspresi p21 dan p27 yang terlibat dalam regulasi siklus sel, serta γH2AX yang berhubungan dengan respon kerusakan DNA pada jalur JNK-dependent. Scriptaid juga dapat menurunkan aktivitas telomerase pada jalur JNK-independent pada sel glioma.

Kesimpulannya, scriptaid merupakan inhibitor HDACs yang berpotensi dalam menghambat pertumbuhan, menghentikan siklus sel, modifikasi histon, dan menginduksi terjadinya apoptosis pada sel kanker (sel glioma). Mekanisme yang mendasari peran scriptaid sebagai inhibitor HDACs memiliki kemungkinan yang berbeda dengan mekanisme yang berlaku pada inhibitor HDACs secara umum.

Referensi:

Allfrey V.G., Faulkner R., Mirsky A.E.. 1964. Acetylation and methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 51: 786–794.

Cameron E.E., Bachman K.E., Myohanen S., Herman J.G. dan Baylin S.B. 1999. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer. Nat Genet. 21: 103-107.

Haberland M., Montgomery R.L., Olson E.N. 2009. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nat Rev Genet. 10: 32–42.

Hu E., Dul E., Sung C.M., Chen Z., Kirkpatrick R., Zhang G.F., et al. 2003. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. J Pharmacol Exp Ther.  307(2): 720-728.

Keen J.C., Yan L., Mack K.M., Pettit C., Smith D., Sharma D., Davidson N.E. 2003. A novel histone deacetylase inhibitor, scriptaid, enhances expression of functional estrogen receptor alpha (ER) in ER negative human breast cancer cells in combination with 5-aza 2'-deoxycytidine. Breast Cancer Res Treat. 81(3): 177-186.

Luger K., Mader A.W., Richmond R.K., Sargent D.F., Richmond TJ. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389:251–260.

Lee E.J., Lee B.B., Kim S.J., Park Y.D., Park J., Kim D.H. 2008. Histone deacetylase inhibitor scriptaid induces cell cycle arrest and epigenetic change in colon cancer cells. Int J Oncol. 33: 767-776.

Monneret C. 2005. Histone deacetylase inhibitors. Eur J Med Chem. 40 (1): 1-13.

Peng L. dan Seto E. 2011. Deacetylation of nonhistone proteins by HDACs and the implications in cancer. Handb Exp Pharmacol. 206: 39–56.

Richon V.M., Sandhoff T.W., Rifkind R.A. dan Marks P.A. 2000. Histone deacetylase inhibitor selectively induces p21WAF1 expression and gene-associated histone acetylation. Proc Natl Acad Sci USA. 97: 10014-10019.

Shahbazian dan Grunstein, 2007. Functions of Site-Specific Histone Acetylation and Deacetylation. Annu Rev Biochem. 76:75–100.

Sharma V, Koul N, Joseph C, Dixit D, Ghosh S, Sen E. 2010. HDAC inhibitor, scriptaid, induces glioma cell apoptosis through JNK activation and inhibits telomerase activity. J Cell Mol Med. 14(8): 2151-2161.

Su G.H., Sohn T.A., Ryu B., Kern S.E. 2000. A novel histone deacetylase inhibitor identified by high-throughput transcriptional screening of a compound library. Cancer Res. 60(12): 3137-3142.