Perbedaan Ekspresi Glikosaminoglikan (GAG) pada Zebrafish (Danio rerio) selama Skeletogenesis

Wike Astrid Cahayani

Glikosaminoglikan (GAG) merupakan polisakarida panjang tidak bercabang yang dibentuk dari pengulangan unit-unit disakarida yang mengandung derivat gula amin (heksosamin), contohnya glukosamin atau galaktosamin, dan mengandung asam uronat (asam glukuronat atau asam iduronat) atau galaktosa. Salah satu gula penyusun dari unit disakarida tersebut minimal memiliki gugus karboksil bermuatan negatif atau gugus sulfat (Berg et al., 2002). Heksosamin, asam uronat, dan galaktosa di setiap unit disakarida dapat disubstitusi dengan gugus sulfat pada gula hidroksilnya, pada posisi 2, 4, dan 6 melalui aktivitas enzim sulfotransferase yang berbeda, sehingga hal ini akan menyebabkan heterogenitas struktur GAG dalam suatu individu (Caterson, 2012).

Glikosaminoglikan terdapat pada matriks ekstraseluler dan cairan biologis dari vertebrata, di mana karbohidrat kompleks ini berinteraksi dengan ratusan protein dan memainkan banyak peran penting dalam tubuh (Frazier et al., 2008). Pada umumnya, GAG akan terikat pada protein untuk membentuk proteoglikan. Proteoglikan lebih cenderung menyerupai karbohidrat daripada menyerupai protein, lantaran 95% berat biomolekulnya tersusun oleh karbohidrat. Proteoglikan berfungsi sebagai lubrikan dan komponen struktural pada jaringan pengikat, mediator adhesi sel pada matriks ekstraseluler, dan salah satu faktor yang menstimulasi proliferasi sel (Berg et al., 2002).

Kelompok utama GAG terdiri atas kondroitin sulfat, keratan sulfat, heparin/heparan sulfat, dermatan sulfat, dan hialuronat (Frazier et al., 2008). Heparan sulfat memiliki kemiripan dengan heparin, akan tetapi heparan sulfat mempunyai gugus N- dan O-sulfat yang lebih sedikit dan gugus asetil yang lebih banyak dibandingkan heparin (Berg et al., 2002). Heparan sulfat, kondroitin sulfat, dan dermatan sulfat akan diikatkan secara kovalen dengan proteoglycan core protein pada saat berada di Golgi melalui sambungan trisakarida (Galactose-Galactose-Xylose) dengan residu serin atau treonin pada protein. Keratan sulfat akan diikatkan dengan proteoglycan core protein melalui N-linked oligosaccharide atau O-linked oligosaccharide yang melekat ke residu asparagin. Hyaluronat merupakan satu-satunya disakarida penyusun GAG yang agak unik karena tidak memiliki gugus sulfat dan tidak dihubungkan dengan core protein, serta disekresikan secara langsung oleh sel ke ruang ekstraseluler (Frazier et al., 2008).

Zebrafish (Danio rerio) merupakan organisme yang populer sebagai model hewan coba yang mewakili vertebrata, oleh karena kemampuannya dalam berkembang biak yang sangat baik serta aspek morfologi dan fisiologinya yang mirip dengan mamalia (Zhang et al., 2009). Sebagai model vertebrata, keunggulan zebrafish dibandingkan tikus, antara lain memiliki siklus hidup yang pendek, dapat dipelihara dengan biaya rendah, dan dapat dilakukan manipulasi genetik dengan mudah. Di samping itu, model zebrafish mutan yang menunjukkan adanya defek pada sintesis proteoglikan maupun sulfasilasi pada GAG dapat menyerupai kondisi penyakit yang berhubungan dengan sistem rangka pada manusia (Wiweger et al., 2011).

Penelitian menggunakan HPLC (high performance liquid chromatography) dan mass spectrometry telah menguraikan diversitas struktur GAG pada spesies zebrafish. Meskipun terdapat penelitian awal yang melaporkan bahwa zebrafish tidak memiliki heparan sulfat sebagai penyusun glikosaminoglikannya (Souza et al., 2007), terdapat penelitian lain yang menunjukkan hasil yang sebaliknya, bahwa embrio zebrafish yang sedang berkembang memiliki kondroitin sulfat maupun heparan sulfat, dan ekspresi dari disakarida penyusun GAG tersebut bersifat dinamis dan diregulasi secara luas (Zhang et al., 2009). Oleh karena bersifat dinamis, komposisi GAG mengalami perubahan dalam setiap tahapan perkembangan zebrafish yang teramati pada fase 0,5 hari, 1 hari, 5 hari dan fase dewasa. Hal ini mengindikasikan bahwa perubahan tersebut (dari segi kuantitas) berperan dalam fungsi yang berbeda di setiap tahap perkembangannya, sehingga diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui peran GAG dalam perkembangan zebrafish.

Hasil penelitian Hayes dan kolega (2013) menjadi salah satu penguat bagi temuan Zhang et al. (2009), di mana penelitian tersebut melaporkan bahwa zebrafish memiliki heparan sulfat dan kondroitin sulfat, dan keduanya terekspresi secara luas pada sistem rangka zebrafish. Perbedaan pada kedua penelitian tersebut terletak pada metode yang digunakan untuk menganalisis disakarida penyusun GAG, di mana Zhang et al. (2009) meggunakan metode HPLC sedangkan Hayes et al. (2013) menggunakan antibodi monoklonal yang mengenali heparan sulfat dan kondroitin sulfat dalam pemeriksaan imunohistokimia.

Heparan sulfat pada proteoglikan telah diketahui berperan penting dalam memodulasi sinyal selama terjadi skeletogenesis pada vertebrata (Farach-Carson et al., 2005). Pada penelitian Hayes et al. (2013), heparan sulfat terdistribusi secara luas pada sistem rangka zebrafish di tahap perkembangan awal, dengan komposisi terbesar pada kartilago kraniofasial. Adanya heparan sulfat pada jaringan pengikat yang berbeda pada zebrafish mengkonfirmasi keterlibatan GAG dalam skeletogenesis, di mana defek pada heparan sulfat akan mengakibatkan abnormalitas morfologi dan fungsi dari jaringan pengikat zebrafish (Wiweger et al., 2011). Selain itu, pentingnya heparan sulfat juga dibuktikan dalam penelitian Holmborn et al. (2012) yang menyimpulkan bahwa biosintesis heparan sulfat akan lebih diprioritaskan dibandingkan biosintesis kondroitin sulfat pada zebrafish yang mengalami mutasi UDP-glucuronate decarboxylase 1 (uxs1) dan beta-1,3-glucuronosyltransferase 3 (b3gat3).

Dari seluruh fase perkembangan yang diamati, kondroitin sulfat cenderung terekspresi di sistem rangka aksial zebrafish. Hal ini terlihat pada usia 3 hari setelah fertilisasi (day-post-fertilization, dpf), kondroitin sulfat terekspresi di sekitar notokorda. Adapun pada usia 4 dpf, kondroitin sulfat juga terekspresi kuat di sekitar notokorda dan sebagian kecil terekspresi lemah di sekitar intersomit. Pada usia 8 dpf, kondroitin sulfat terekspresi di daerah dorso-ventral dan semakin meluas ke daerah vertebral dan haemal arches pada pengamatan beberapa hari sesudahnya. Ekspresi kondroitin sulfat ini bersifat dinamis selama terjadinya skeletogenesis, di mana hal ini mungkin merefleksikan sinyal-sinyal yang terjadi selama perkembangan rangka aksial zebrafish yang meliputi bagian tengkorak dan batang tubuh (Hayes et al., 2013).

Hayes et al. (2013) juga menyimpulkan bahwa adanya perbedaan tipis yang teramati pada ekspresi disakarida penyusun GAG selama skeletogenesis mengindikasikan peran fungsional yang berbeda dalam pembentukan sistem rangka pada zebrafish. Hal ini diduga juga mencerminkan mekanisme skeletogenesis pada kelas vertebrata yang lebih tinggi, di mana ekspresi GAG diregulasi dengan sangat baik selama skeletogenesis untuk memenuhi peran fungsional yang berbeda.

Baik penelitian Zhang et al. (2009) maupun Hayes et al. (2013) tidak membahas mengenai peran fungsional ataupun mekanisme yang mendasari perbedaan komposisi atau ekspresi GAG pada setiap tahap perkembangan zebrafish yang diamati. Zhang et al. (2009) menyimpulkan bahwa terdapat perbedaan kuantitas GAG dan perbedaan komposisi penyusun GAG (heparan sulfat dan kondroitin sulfat) pada tahapan usia zebrafish yang berbeda, sedangkan Hayes et al. (2013) menekankan adanya perbedaan pola ekspresi atau distribusi disakarida penyusun GAG pada sistem rangka zebrafish pada usia 3-8 dpf. Namun, keduanya sepakat pada satu hal: adanya perbedaan komposisi maupun distribusi disakarida penyusun GAG mendukung tercapainya peran fungsional yang juga berbeda di setiap tahap perkembangan zebrafish.

Referensi:

Berg J.M., Tymoczko J.L., dan Stryer L. 2002. Biochemistry, 5th edition. New York: W. H. Freeman and Company.

Caterson B. 2012. Fell-Muir Lecture: Chondroitin sulphate glycosaminoglycans: fun for some and confusion for others. Int J Exp Path. 93: 1–10.

Farach-Carson M.C., Hecht J.T., Carson D.D. 2005. Heparan sulfate proteoglycans: key players in cartilage biology. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 15: 29-48.

Frazier S.B., Roodhouse K.A., Hourcade D.E., Zhang L. 2008. The Quantification of Glycosaminoglycans: A Comparison of HPLC, Carbazole, and Alcian Blue Methods. Open Glycosci. 1: 31-39.

Hayes A.J., Mitchell R.E., Bashford A., Reynolds S., Caterson B., Hammond C.L. 2013. Expression of Glycosaminoglycan Epitopes During Zebrafish Skeletogenesis. Developm Dyn. 242: 778-789.

Holmborn K., Habicher J., Kasza Z., Eriksson A.S., Filipek-Gorniok B., Gopal S., et al. 2012. On the roles and regulation of chondroitin sulfate and heparan sulfate in zebrafish pharyngeal cartilage morphogenesis. J Biol Chem. 287: 33905-33916.

Souza A.R., Kozlowski E.O., Cerqueira V.R., Castelo-Branco M.T., Costa M.L., Pavão M.S. 2007. Chondroitin sulfate and keratan sulfate are the major glycosaminoglycans present in the adult zebrafish Danio rerio (Chordata-Cyprinidae). Glycoconj J. 24: 521-530.

Wiweger M.I., Avramut C.M., de Andrea C.E., Prins F.A., Koster A.J., Ravelli R.B., Hogendoorn P.C. 2011. Cartilage ultrastructure in proteoglycan-deficient zebrafish mutants brings to light new candidate genes for human skeletal disorders. J Pathol. 223: 531-542.

Zhang F., Zhang Z., Thistle R., McKeen L., Hosoyama S., Toida T., Linhardt R.J., Page-McCaw P. 2009. Structural characterization of glycosaminoglycans from zebrafish in different ages. Glycoconj J. 26: 211-218.